Listeria

 

Méthodes d'isolement, de recherche et d'identification des Listeria :

 

ECHANTILLONNAGE :

L'échantillon doit être représentatif, non endommagé ou modifié lors du transport et de l'entreposage.

La contamination d'un produit alimentaire :

La contamination d'un produit alimentaire est aléatoire : elle peut intervenir à tous les stades, étant donné que le genre Listeria est ubiquitaire. Un produit peut être contaminé par plusieurs groupes, sérotypes ou lysotypes de Listeria.


Traitement de l'échantillon :

Les Listeria peuvent subir des agressions dues à la préparation des aliments (chauffage, pH très bas...). Il est alors indispensable de revivifier les germes si on veut avoir toutes les chances de les isoler. Pour cela, on peut réaliser un pré-enrichissement.


 

L'ENRICHISSEMENT ET L'ISOLEMENT :

Les Listeria sont en général en petit nombre dans les aliments et sont accompagnées d'une flore associée abondante. C'est pour ces raisons qu'une phase d'enrichissement sélectif est indispensable. A la suite de l'enrichissement, on pratique un isolement sur des milieux sélectifs.

 



IDENTIFICATION :

Pour toutes les méthodes "d'enrichissement" comme d'isolement vue précédemment, on réalise une identification par des tests morphologiques, physiologiques et biochimiques (galerie de tubes ou galerie miniaturisée) :

~ isolement des colonies caractéristiques sur TSAYE, Tryptone Soya Agar Yeast Extract, (37°C/24 heures).

~ identification du genre : Gram, catalase, mobilité à partir d'un état frais par TSBYE à 25°C pendant 8 à 24 heures ou sur milieu mobilité.

~ identification de l'espèce : CAMP (37°C/48 heures), hémolyse sur gélose au sang (37°C/48 heures), xylose, rhamnose à partir de bouillon TSBYE (37°C/24à 48 heures).

Ou, on peut identifier la souche par d'autres méthodes donnant des résultats équivalents.

La galerie miniaturisée API Listeria est constituée de 10 tests qui permettent d'identifier les genres, espèces et sous espèces de Listeria. L'identification est réalisée en 24 heures sans nécessité de tests complémentaires. Ce test reconnaît 85% des 646 souches de Listeria. La galerie API Listeria comporte 10 microtubes contenant des substrats déshydratés, qui permettent la réalisation de tests enzymatiques ou des fermentations de sucres. Les réactions produites pendant l'incubation se traduisent par des changements de coloration spontanés ou révélés par l'addition de réactifs. Après 18-24 heures à 35-37°C, la lecture des réactions est réalisée visuellement avec le tableau de lecture et l'identification obtenue grâce à la liste des profils de la notice technique. Avant d'ensemencer une galerie API Listeria, on doit vérifier l'appartenance de la souche à étudier au genre Listeria :

- bacilles courts Gram positif polymorphes

- mobilité à 25°C mais pas à 37°C

- tests enzymatiques : catalase+ et oxydase-

Comme les prélèvements contiennent en général des mélanges de plusieurs espèces de Listeria, il est préférable de réaliser une subculture sur gélose au sang à partir d'une colonie bien isolée incuber la boîte 24 heures à 35-37°C.

 

Remarque : il est possible d'utiliser les milieux suivants pour prélever les colonies avant utilisation de la galerie API Listeria :

~ gélose au sang non sélectif, à base Columbia ou TSA, avec ou sans antibiotiques.

~ milieux sélectifs pour Listeria à l'exception du milieu Mc Bride qui inhibe l'expression enzymatique des bactéries sur la galerie API Listeria. Si ce milieu est employé pour l'isolement, il faut réaliser une subculture sur gélose au sang.

Les 10 tests réalisés sont :

~ Dim différenciation L. innocua / L. monocytogenes

Le test est fondé sur l'hydrolyse d'un substrat naphtylamide par une arylamidase. La réaction est la suivante :

E
R- naphtylamide --------------> naphtylamide + R

R = radicale acide aminée

E = arylamidase

 

On détecte la naphtylamide par le réactif ZYMB (sel de diazonium) pour former un composé azoïque coloré en orange. L. innocua possède l'arylamidase.

~ Esculine

Le test est basé sur l'hydrolyse de l'esculine par la glucosidase. La réaction est :

glucosidase
esculine---------------------> D glucose + esculétine
 

La détection de l'esculine positif se fait par la formation d'un complexe marron foncé à noir. Toutes les Listeria sont esculine positif (confirmation du genre).

~ mannosidase

Ce test chromogénique est fondé sur l'hydrolyse du paranitrophényl D mannopyranoside par l' mannosidase. La réaction est :

mannosidase
para nitrophényl D mannopyranoside---------------> D mannose + para nitrophénol

 

~ Sept substrats glucidiques sont testés en fermentation : D arabitol, D xylose, rhamnose, méthyl D glucoside, ribose, glucose 1 phosphate et D tagatose.

La fermentation se déroule en anaérobiose. La fermentation de produits acides fait varier l'indicateur de pH (rouge de phénol). Les Listeria sont DARL positif (confirmation du genre).

L'hémolyse est lisible sur la gélose au sang de mouton. Le CAMP test est indispensable. Il s'agit de l'appréciation d'une "super hémolyse" en présence d'une souche test soit de Staphylococcus aureus, soit de Rhodococcus equi.


METHODES D'ANALYSE RAPIDE :

Les industriels veulent déterminer rapidement si leur produit est contaminé par des micro-organismes afin de réagir face à une contamination le plus vite possible. En ce qui concerne les Listeria, seule L. monocytogenes est reconnue pathogène pour l'homme. C'est pour cette raison que l'on exige l'absence de L. monocytogenes dans 25 grammes de produits, et pour les fromages dégraissés dont la teneur en eau est inférieure à 56%, l'absence de L. monocytogenes dans 1 gramme. Ainsi, une dizaine de systèmes commerciaux ce sont développés pour les analyses de présences/absence de Listeria. Parmi ces systèmes, les plus efficaces sont :

- l'immunoenzymologie

- la biologie moléculaire

Mais, dans tous les cas, on doit réaliser un enrichissement des échantillons (car la détection de Listeria requiert la présence d'environ 104 à 105 bactéries/ml).

 

Technique d'enrichissement rapide par immunocapture :

Le principe de l'immunocapture :

Des billes magnétiques sont recouvertes d'Ac polyclonaux spécifiques des Listeria. Elles sont ensuite extraites et concentrées par aimantation. Il existe 2 kits utilisant ce principe : Listertest et Listerscreen. Ces 2 kits détectent uniquement le genre Listeria.

~ Listertest permet l'isolement et la numérotation de Listeria en 24 heures sans enrichissement préalable. Il permet de dénombrer des contaminants non décelables par la méthode de numération sur gélose.

~ Listerscreen demande une période d'enrichissement de 18 à 20 heures sur Fraser1/2 suivie d'une concentration immunomagnétique de 2 heures qui remplace la phase d'enrichissement secondaire. Couplé à un milieu sélectif (Palcam), Listerscreen permet la détection de Listeria en 72 heures. Ce couplage Listerscreen-Palcam est en cours de validation Afnor. Mais, il peut être couplé à d'autres méthodes rapides (sondes, EIA,...).


L'immunodétection :

~Listertek met en oeuvre le principe de la méthode immuno-enzymatique ELISA.

~Le test de Transia Diffchamb est également basé sur une réaction immuno-enzymatique de type sandwich. Il est réalisé en 90 minutes après 48 à 72 heures d'enrichissement sur bouillon UVM1 et Fraser (cf. annexe 2),pour les produits carnés, ou bouillon LEB avec additifs F3, mis au point par Transia (pour les produits laitiers). Un protocole utilisant les bouillons 1/2 Fraser+Fraser est actuellement en cours de validation auprès de l'Afnor.

~Le test TECRA de 3M est basé lui aussi sur une réaction immuno-enzymatique de type ELISA pour la détection Listeria. Il donne un résultat dès le troisième jour par lecture visuelle (microplaques constituées de cupules sécables les unes des autres au fond desquelles sont fixés les anticorps spécifiques). La confirmation des résultats positifs s'effectue sur les bouillons d'enrichissement sélectifs.

Principes de la méthode immuno-enzymatique ELISA type sandwich appliquée dans les kits Listertek, Transia et le test Tecra:

Les anticorps spécifiques du genre Listeria sont absorbés sur un support (fond des cupules). Si l'échantillon est contaminé par le genre Listeria, les Listeria vont être reconnues par les anticorps et ainsi vont former un complexe anticorps-antigènes. On ajoute ensuite des anticorps spécifiques du genre Listeria, conjugués à une enzyme. Ceux-ci vont reconnaître le complexe anticorps-antigène et vont se fixer dessus. Ainsi l'antigène est pris en "sandwich" par les anticorps. Enfin, pour détecter la présence des Listeria, on ajoute le substrat spécifique de l'enzyme, qui va former un produit coloré.

~Listeria rapide test d'unipath permet la détection des Listeria en 43 heures. Le test est fondé sur la technique d'immunochromatographie Cleariew Listeria après 2 étapes d'enrichissement de 21 heures chacune (bouillon 1/2 Fraser et bouillon tamponné d'enrichissement pour Listeria BLEB). Le résultat est obtenu en 20 minutes. Ce test n'a pas encore obtenu la validation de l'Afnor.

Ces 4 tests ne permettent pas dans leur formule actuelle, la confirmation rapide de l'espèce monocytogenes.

~Il existe encore un test d'immunodétection qui est le test mini Vidas Listeria de Biomérieux. Il met en oeuvre la méthode ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay). Il permet la détection des Listeria en 45 minutes après 2 phases d'enrichissement de 22 heures chacune.

La limite de détection est comprise entre104 et 105 bactéries/ml. Biomérieux a également créé un kit Vidas Listeria monocytogenes. Après 2 phases d'enrichissement de 24 heures chacune, le résultat est obtenu en 70 minutes. Il permet la détection directe de Listeria monocytogenes et peut être utilisé, également en confirmation de colonies suspectes sur boîte. La sensibilité est de 5.105 Listeria monocytogenes dans le dernier bouillon d'enrichissement. Ce test spécifique des Listeria est le kit LMO. Avec Vidas, il offre la possibilité d'utiliser en parallèle les kits Listeria et Listeria monocytogenes pour obtenir en 48 heures la double information genre et espèce.

Toutefois on reproche aux méthodes immuno-enzymatiques certains problèmes de faux positifs (dues aux anticorps peu spécifiques) et leur manque de spécificité.


Les sondes nucléiques :

- Euralam commercialise la technique rapide AccuProbe Gen-Prob pour la recherche de Listeria monocytogenes.

Gen-Prob utilise le principe de l'hybridation d'acide nucléiques, qui est basé sur la capacité des brins complémentaires (d'ARN ou d'ARN) à s'associer spécifiquement de façon à former des complexes stables à double brins. Gen-Prob utilise une sonde d'ADN constituée d'un simple brin sur le quel est fixé un marqueur luminescent (ester d'acridinium). Cette sonde est complémentaire d'une séquence de l'ARNr du germe ciblé.

Après une première étape de lyse qui conduit à la libération de l'ARNr des bactéries, celui-ci se combine avec la sonde marquée pour former un hybride ARN/ADN stable.

L'addition du réactif de sélection permet l'hydrolyse de l'ester d'acridinium non protégé dans l'hybride. Puis l'addition d'une solution d'H2O2 initie, en milieu alcalin, la réaction luminescentes. Cette réaction est toujours totale et très rapide. L'identification peut se faire sur un bouillon de culture de 48 heures ( ou à partir d'un milieu solide).

Le temps de manipulation est de 45 minutes.

Elle est en cours de validation AFNOR pour les produits laitiers.


- Le test Gene-Trak associe deux technologies : celles des sondes nucléiques et de la détection colorimétrique. La durée du test est de 48 à 72 heures. La limite de détection de la méthode est de 106 à 107 UFC/ ml. Toutefois, pour certains produits tels que les fromages au lait cru à forte flore associée et certains produits de la mer, une prévention d'usage est à appliquer : effectuer une subculture à partir de l' enrichissement en milieu Fraser, selon le protocole décrit dans la norme AFNOR V 08. 055, les isolements étant effectués sur milieu Oxford.

Il existe deux kits Gene-Trak :

- le kit DNA GT 602 pour la détection de Listeria validé par l'AFNOR pour tous produits alimentaires.

- le kit DNA GT 604 pour la détecter Listeria monocytogenes, validation AFNOR en cours.

Principe du Gene-Trak :

Après enrichissement de l'échantillon, les bactéries sont lysées pour extraire l'ARN ribosomique dans une solution alcaline. (les bactéries Gram positif nécessite un traitement enzymatique). On introduit alors deux sondes spécifiques, homologues à deux séquences d'un ARN ribosomique cible:

- la sonde de capture qui contient une séquence polydA (acide polydéoxyadénylique).

- la sonde de détection qui est marquée des deux côtés par une molécule de fluorescéine.

La capture est réalisée à l'aide d'un support solide (dipstick) enduit d'acide polydéoxythmidylique (polydT) qui s'hybride avec le polydA de la sonde de capture, entraînant avec elle l'hybride formé de l'ARNr et des deux sondes spécifiques. Le complexe hybride capturé sur le dipstick est mis en contact avec l'Ac antifluorescéine conjugué à l'enzyme horseradish péroxidase (HRP), puis avec le substrat de l'HRP et un chromogène. L'absorption, mesurée à 450 nm, sera proportionnelle à la quantité de conjugué antifluorescéine HRP lié à l'hybride.

Il existe maintenant un automate qui permet de traiter 70 échantillons en 2 heures avec un temps de manipulation limité à 20- 30 minutes par série d'analyses.

La société DNA (diagnostics nouveaux alimentaires) propose également une technologie couplant la méthode d'enrichissement rapide par amplification génique et les sondes nucléiques brevetées par l'institut Pasteur pour une détection plus rapide.

Le principe de l'amplification génique est d'utiliser d'une manière répétée l'activité d'une ADN-polymérase en présence d'une amorce pour copier en grande quantité la séquence initiale de l'ADN et donc l'amplifier en milliers de fois. Les fragments d'ADN sont ensuite séparés par électrophorèse.

DNA propose deux tests :

- le test DNA 001 qui permet le diagnostic rapide de Listeria monocytogenes et du genre Listeria en 56 heures. Ce test détecte 102 Listeria monocytogenes après 48 heures d'enrichissement sur gélose.

- le test DNA 002 permet la numération des Listeria monocytogenes en 72 heures.

Avantages des tests de biologie moléculaire :

- grande spécificité

- aucune réaction croisée n'est observée à la différence des tests immunologiques.

- tests très rapides par rapport aux techniques classiques.


Impédance-métrie :

La société Radiometer commercialise des automates Malthus, basés sur un principe de mesures par conductance-métrie qui mesure les variations électriques du milieu de culture en fonction du temps.

Pour la recherche de Listeria, il existe deux protocoles dont un appliqué aux produits alimentaires.

Les deux protocoles nécessitent un pré-enrichissement de 24 heures.

Un résultat négatif est obtenu en 54 heures (24 heures de pré-enrichissement plus 30 heures de mesure en automate ).

Un résultat positif est obtenu en 35 heures (24 heures de pré-enrichissement plus 11 heures en automate).

Les échantillons positifs doivent être confirmés (sur boîte ou en kits).

La méthode n'est pas encore validée.